摘 要 自二十世纪八十年代杂交瘤技术建立以来，抗体制备技术取得了长足的发展。抗体是由B淋巴细胞分泌的一种免疫球蛋白，因其能与受体特异性结合而产生许多生物学活性，如经典阻断作用、中和活性、激活补体、通过Fc受体对靶细胞产生杀伤作用和调节机体免疫活性等，在临床治疗中广泛应用。抗体技术的发展经历了鼠源性单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体和全人源单克隆抗体的漫长历程。从鼠源性抗体到全人源抗体的过渡中，实现了多种生物技术的突破，如抗体库技术、人源化小鼠技术和B细胞克隆技术等。如今，抗体药物在整个药物市场中拥有举足轻重的地位。十年来( 2011年1月 ～ 2021年 11月) ，已有78种单克隆抗体药物被FDA批准上市使用，广泛分布于肿瘤领域、免疫性疾病领域、抗病原体感染领域、神经系统和代谢性疾病领域。文章就单克隆抗体技术进展和抗体药物上市情况进行综述，为新型抗体的制备和药物靶点的选择提供了思路。早在1975年，Köher和Milstlein将小鼠B细胞和骨髓瘤细胞进行融合，从而开发出B淋巴细胞杂交瘤技术，为单克隆抗体的研发奠定了基础［1］。单克隆抗体的技术发展经历了多个阶段，早期的单克隆抗体均为鼠源性单克隆抗体，由于该抗体作为异源蛋白，在人体会产生人抗鼠抗体( Hu- man anti-mouse antibody，HAMA) ，从而影响治疗效果和产生较多毒副作用等被限制使用［2］。随后，对鼠源单克隆抗体结构进行了改造，用人源基因序列替换鼠源的抗体恒定区，从而设计出人-鼠嵌合抗体; 进一步使用人源互补决定簇( Complementarity-determining regions，CDＲ) 碱基序列替换鼠源CDＲ序列，制备出人源化抗体。随着现代生物技术的发展和对抗体结构认识的深入，已实现全部碱基序列的人源化，制备了全人源单克隆抗体。鼠源性单克隆抗体起源于1975年，Köhler和Milstein使用仙台病毒，将小鼠骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞进行融合，形成杂交瘤细胞［1］。该杂交瘤细胞不仅能分泌抗体，还具备永生化的特性，在生物技术领域具有里程碑意义。抗体的可变区( V) 是特异性识别抗原的位点，而恒定区( C) 与抗原识别无关。20世纪80年代后期，为解决鼠源性单抗在人体使用时产生的HAMA等毒副作用，科学家们将鼠源性单抗恒定区基因序列替换成人的基因序列，制备出人-鼠嵌合抗体。
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Li Gui等［3］报道，使用人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体( SCT400) 治疗非霍奇金淋巴瘤取得了良好效果。Zhang Z等报道，Metuzumab在小鼠、大鼠和食蟹猴中具有抗非小细胞肺癌的效果。Metuzumab是抗CD147的人-鼠嵌合 IgG1单克隆抗体［4］。嵌合抗体虽然将恒定区序列人源化，但仍保留约30%的鼠源序列。对抗体的可变区进一步研究发现，无论轻链和重链，与抗原特异性识别主要由6个CDＲ决定，而可变区的其它序列仅为支架作用，且具有保守型。将鼠源CDＲ序列移植到人的抗体骨架上，便形成了人源化抗体。在一项临床1B期试验中［5］，北京大学肿瘤医院郭军团队证实Toripalimab 联合Axitinib对治疗转移性黏膜黑色素瘤具有明显效果。Toripalimab是一种人源化抗PD-1的IgG4单克隆抗体，Axitinib是血管内皮生长因子( VEGF) 抑制剂，两者联合使用在晚期黑色素瘤的治疗中取得了初步疗效。另一项研究证实，人源化双特异性抗体Emicizumab ( AVE910) 每周一次皮下注射后可显著降低严重血友病 A患者的出血率，可降低输入凝血因子Ⅷ而带来的严重负担和抗Ⅷ因子抗体的形成［6］。在20世纪末，科学家们尝试使用全部人源的序列制备抗体，从而诞生了全人源单克隆抗体。当前全人源抗体技术主要包括抗体库技术、人源化小鼠技术和B细胞克隆技术。1. 4. 1 抗体库技术 抗体库技术是指通过DNA重组克隆技术扩增出B细胞中全套抗体可变区序列，再将原核生物的前导序列拼接到抗体分子可变区的氨基端，由于原核生物周质腔的环境与真核细胞粗面内质网类似，抗体分子片段可在周质腔中折叠，形成具有抗原结合能力的异二聚体结构，从而可筛选出具有特定结合能力的抗体。经过对抗体表达系统深入研究，逐渐形成了噬菌体展示技术、酵母展示技术、核糖体展示技术以及哺乳动物细胞表面展示技术等。早在1985年，Smith首次将外源基因插入丝状噬菌体f1的Ⅲ基因中，创建了噬菌体展示技术［7］。Yun S等在筛选人表皮生长因子受体2( HEＲ2) 时，通过将HEＲ2固定在二氧化硅包被的磁珠( MPs) 进行阳性筛选，可显著提高筛选出的HEＲ2的亲和力［8］。Shukla GS等利用静脉输入ScFv单链抗体噬菌体文库的方式，首次报道了在Ⅳ期肿瘤患者体内筛选的特异性结合抗体的新方法，成功发现克隆07-2355与已报道的IL-17A具有高度同源性，为噬菌体库的体内筛选提供了一种新思路［9］。1997年，Boder和 Wittrup利用外源基因与凝集素C端编码序列重组，首次建立了酵母展示系统。Zhao JZ等［10］报道，利用抗传染性造血坏死病毒抗体的可变区作为靶向展示蛋白，将酵母来源的ScFv展示在酵母表面，再通过人工锚定的方法将大肠杆菌来源的ScFv也展示在同一酵母上，可显著提高酵母表面的总ScFv水平。Hanes和Plückthun于1997年首次建立了核糖体展示技术( Ｒibosome display technology，ＲDT) ［11］。核糖体展示技术相对噬菌体展示技术和酵母展示技术，具有建库简单、库容量大、筛选方式简单等优点。Lagoutte P等［12］ 利用核糖体展示技术成功筛选出与CTX-M15具有高度亲和力的蛋白分子。Akamatsu首次利用哺乳动物细胞表面展示技术进行的筛选，并成功获得特异性抗体［13］。Bruun TH等报道利用一个嵌合HIV-1 Env模型库，成功筛选出与Env具有高度亲和性的抗体447-52D和HGN194，该技术可指导鉴定具有优化抗原特性的Env变种，可作为候选疫苗使用［14］。1. 4. 2 人源化小鼠技术 人源化小鼠抗体技术是指利用基因工程技术，将动物体内免疫球蛋白基因替换成人类免疫球蛋白基因，从而在动物体内直接表达全人源抗体蛋白。1983年，Brinster等就将重排后具有功能的人的免疫球蛋白κ 基因采用显微注射方式注入小鼠卵细胞，制备出能在脾脏特异表达免疫球蛋白 κ 基因的转基因小鼠，开启了人源化小鼠在免疫学领域的研究［15］。第一 代人源化小鼠是由Brüggemann于1989年 报道［16］，是直接将人的免疫球蛋白基因转入动物体内，一般只能转入5000kb以下的基因片段，转入基因片段的调控受到限制，重排多样性也受到制约［17］; 第二代人源化小鼠是在第一代的基础上，利用胚胎干细胞和体内同源重组等技术，分多次将完整的人免疫球基因转入小鼠体内，有利于抗体的重排选择; 由于转入的人源基因序列对鼠B细胞的发育、抗体类型转换、抗体亲和力成熟有一定的影响; 第三代人源化小鼠，仅将人的免疫球蛋白V区、D区和J区转入替换小鼠的免疫球蛋白V区、D区和J区，解决了早期B细胞发育的问题［18］，再经二次改造，形成全人源抗体。当前人源化小鼠技术相对成熟，利用该技术制备的全人源抗体也越来越多的被批准上市。全球有几家公司已成功培育出相对成熟的人源化小鼠品系，如 Cell Genesys公司的XenoMouse小鼠、美国Medarex公司的UltiMab小鼠、Harbour公司的H2L2和HCAB小鼠、OmniAb公司的OmniMouse小 鼠、美国Ｒegen-eron公司的VelocImmune小鼠等［19-22］。1. 4. 3 B细胞克隆技术单个B细胞分选制备抗体是指从人外周血或骨髓中样本中，采用特定的抗原标记进行染色，使用流式细胞分选技术筛选出单个 B 细胞，通过裂解、逆转录、巢式PCＲ或3'ＲACE ( Ｒapid-amplification of cDNA ends) 技术分别扩增出抗体的重链和轻链序列，再重组至适宜载体进行表达的过程。Ｒudkin FM等［23］报道利用单个人B细胞，制备出抗念珠菌的单克隆抗体，对传播性念珠菌的预防具有保护作用。Alberto C等［24］报道，从一名感染埃博拉病毒( EBOV) 的人类幸存者中采用单个B细胞技术，扩增出抗体的重链和轻链基因序列，并表达形成了具有中和能力的单克隆抗体mAb114。2019年，新型冠状病毒被报道在人群中流行，目前已造成世界范围内传播，该病毒表面刺突糖蛋白( S) 的受体结合域( ＲBD) 能与人血管紧张素转化酶2( ACE2) 结合，导致严重呼吸道疾病和肺炎。Wu Y等［25］报道，运用单个B细胞抗体扩增技术，从一名康复期患者身上分离出全人源单克隆抗体B38和 H4 能阻断病毒S蛋白ＲBD和细胞受体ACE2结合，并在小鼠模型上证实，该抗体能降低感染肺部的病毒滴度，从而具有广泛的治疗前景。2011～2021年，十年中有78种单克隆抗体药物在美国FDA获批上市。其中人源化单克隆抗体32种，占41. 03% ;全人源单克隆抗体29种，占37. 18% ; 人鼠嵌合抗体5种， 占6. 41% ; 此外还有10种抗体药物偶联物( Antibody-drug conjugate，ADC) ，占12. 82% 和2种双特异性抗体( Bispecific antibody) ，占2. 56% ( 图 1) 。随着现代生物技术的发展和基础医学的深入研究，抗体药物的应用已涵盖肿瘤领域、免疫性疾病领域、病原体感染性疾病、代谢性疾病、遗传性疾病和神经系统疾病等领域。单克隆抗体药物识别的靶点 也 越 来 越 多 的 被 报 道，如免疫检查点抑制剂PD-1、PD-L1、CTLA4 等，肿 瘤 相 关 抗 原GD2、HEＲ2、 VEGFＲ等，细胞因子和趋化因子IL-6、IL-17A、IL-23、 CD19、CCＲ4等［26-29］( 表 1) 。
肿瘤治疗领域一直是单克隆抗体药物研发的主要方向，十年来，有34种治疗肿瘤的单克隆抗体药物获批上市，占总上市单克隆抗体药物的43. 59% 。单克隆抗体治疗的肿瘤类型主要集中于乳腺癌、骨髓瘤、B细胞淋巴瘤、膀胱癌和黑色素瘤等，此外还包括神经母细胞瘤、鳞状细胞癌、毛细胞白血病、软组织肉瘤、非小细胞肺癌、胃癌、成神经细胞瘤以及霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤等。其中治疗乳腺癌的单克隆抗体治疗靶点主要为HEＲ2，包括 Margetu- ximab、Fam-trastuzumab deruxtecan-nxki、Ado-trastuzumab emtansine 和 Pertuzumab，此 外 还 包 括 针 对Trop-2靶 点 的ADC 药物 Sacituzumab govitecan-hziy。治疗骨髓瘤的单克隆抗体的种类和针对靶点比较丰富，包括靶向BCMA的ADC抗体药物Belantamab mafodotin-blmf、靶向CD38的人鼠嵌合抗体Isatuximab、靶向 SLAMF7 的人源化抗体Elotuzumab以及靶向CD38的全人源抗体Daratumumab。治疗B细胞淋巴瘤的单克隆抗体包括靶向CD19的人源化抗体Tafasitamab- cxix、靶向CD79b的ADC抗体药物Polatuzumab vedotin-piiq和靶向PD-1 的人源化抗体Pembrolizumab。值得注意的是， 2014年12月3日，FDA批准了抗体药物Blinatumomab上市，用于治疗B细胞淋巴瘤。此抗体药物是首例获批的双特异性抗体药物，同时靶向CD19和CD3［30］。治疗膀胱癌的抗体药物包括靶向PD-L1的全人源抗体Durvalumab和人源化抗体 Atezolizumab，以及靶向Nectin-4的ADC药物Enfortumab vedotin-ejfv。治疗黑色素瘤的单克隆抗体药物上市较早，均为免疫检查点抑制剂，包括2014年12月22日上市的靶向PD-1的全人源抗体Nivolumab和2011年3月 25日上市的靶向CTLA-4的全人源抗体Ipilimumab。除此之外，还有治疗其它十余种肿瘤的单克隆抗体药物获批上市，针对的治疗靶点和抗体种类也不尽相同。比如靶向GD2的人源化抗体Naxitamab-gqgk( 治疗神经母细胞瘤) 和人鼠嵌合抗体Dinutuximab( 治疗成神经细胞瘤) ;靶向 CD22的人源化抗体Moxetumomab pasudotox-tdfk( 毛细胞白血病) 和 ADC 抗体药物Inotuzumab ozogamicin( 治疗急性淋巴细胞白血病) ; 靶向 PDGFＲ-α的全人源抗体Olara- tumab( 治疗软组织肉瘤) ; 靶向EGFＲ的全人源抗体 Necitu- mumab( 治疗非小细胞肺癌) ; 靶向VEGFＲ2的全人源抗体Ｒamucirumab( 治疗非小细胞肺癌) 以及靶向CD30的ADC抗体药物 Brentuximab vedotin( 治疗霍奇金淋巴瘤) 和靶向CCＲ4的人源化抗体 Mogamulizumab-kpkc( 治疗非霍奇金淋巴瘤) 等。
免疫性疾病的治疗领域是单克隆抗体药物开发的第二大热点，十年来，已有 17种单克隆抗体药物获批上市，占总上市单克隆抗体药物的21. 79% 。单克隆抗体治疗免疫性疾病的主要类型包括斑块状银屑病、重症哮喘和多发硬化症，此外还包括淋巴组织细胞增生、类风湿关节炎、过敏性皮炎、溃疡性结肠炎和红斑狼疮。其中，治疗斑块状银屑病的单克隆抗体主要靶向IL-23和IL-17A，包括靶向IL-23的人源化抗体Ｒisankizumab-rzaa、人源化抗体 Tildrakizumab 和全人源抗体 Guselkumab; 靶向IL-17A的全人源抗体 Broda- lumab、人源化抗体Ixekizumab和全人源抗体Secukinumab。治疗哮喘的单克隆抗体均为靶向IL-5的人源化抗体，包括Benralizumab、Ｒeslizumab和Mepolizumab。治疗多发硬化的单克隆抗体包括靶向CD20的人源化抗体Ocrelizumab和靶向IL-2Ｒα的人源化抗体Caclizumab。除此之外，在免疫性疾病的单克隆抗体治疗领域，还有靶向INF-γ的全人源抗体Emapalumab-lzsgemapalumab-lzsg ( 治疗淋巴组织细胞增生) 、靶向 IL-6的全人源抗体 Sari- lumab( 治疗类风湿关节炎) 、靶向 IL-4 的全人源抗体Dupi- lumab( 治疗过敏性皮炎) 、靶向α4β7 integrin的人源化抗体Vedolizumab( 治疗溃疡性结肠炎) 和靶向BLyS 的全人源抗体 Belimumab( 治疗红斑狼疮) 等获批上市。单克隆抗体治疗病原体感染性疾病是最直接有效的手段。十年来，有6种单克隆抗体药物获批上市，占总上市单克隆抗体药物的7. 69% 。治疗病原体感染性疾病的单克隆抗体获批上市种类较少，且主要集中在烈性传染性疾病，包括治疗埃博拉的全人源抗体Ansuvimab-zykl 和Atoltivimab， Maftivimab，Odesivimab-ebgn，直接靶向埃博拉病毒或病毒的GP1蛋白; 靶向HIV-1，治疗HIV的病毒感染的人源化抗体Ibalizumab-uiyk; 靶向C. difficile toxin B，治疗艰难梭菌感染的全人源抗体Bezlotoxumab; 以及靶向 PA component，治疗炭疽的人鼠嵌合抗体Obiltoxaximab和全人源抗体Ｒaxi- bacumab等。单克隆抗体药物在代谢性疾病领域也有涉及。十年来，有4种抗体药物获批上市，占总上市单克隆抗体药物的5. 13% 。单克隆抗体药物在代谢性疾病治疗领域的开发主要集中于高胆固醇血症和甲状腺眼病。其中治疗高胆固醇血症的靶点为PCSK9和ANGPTL3，上市的抗体药物包括靶向PCSK9的全人源抗体 Evolocumab和Alirocumab，以及靶向ANGPTL3的全人源抗体 Evinacumab-dgnb。治疗甲状腺眼病的单克隆抗体为靶向IGF-1Ｒ的全人源抗体Teprotu- mumab-trbw。单克隆抗体在神经性疾病和遗传性疾病领域均有药物获批上市。十年来，分别有7种治疗神经性疾病的单克隆抗体和5种治疗遗传性疾病的单克隆抗体药物获批上市，分别占已上市单克隆抗体药物的8. 97% 和6. 41% 。在神经性疾病领域，已上市的单克隆抗体药物主要用于偏头痛和视神经脊髓炎的治疗。其中治疗偏头痛的药物均以CGＲP为靶点，包括人源化抗体 Eptinezumab-jjmr、Galcane- zumab-gnlm、Fremanezumab-vfrm和 全 人 源 抗 体 Erenumab- aooe。治疗视神经脊髓炎的单克隆抗体药物包括靶向 IL-6的人源化抗体 Satralizumab-mwge 和靶向CD19的人源化抗体Inebilizumab-cdon。在遗传性疾病领域，已上市的单克隆抗体药物包括靶向P-selectin，治疗镰刀型贫血症的人源化抗体Crizanlizumab- tmca; 靶向Blood clots，治疗血小板减少性紫癜的人源化抗体Caplacizumab-yhdp; 靶向Plasma kallikrein，治疗遗传性血管水肿的全人源抗体 Lanadelumab; 靶向 FGF23，治疗遗传性佝偻病的全人源抗体Burosumab-twza 以及靶向Activated factor IX、X，治疗A型血友病的人源化抗体 Emicizumab。新型冠状病毒( COVID-19) 在2019全球暴发流行，给世界人民健康和经济发展带了严峻考验。基于抗体技术的发展，科学家们迅速研发出针对新冠病毒的治疗性单克隆抗体，并在临床治疗中效果显著。截 止2021年6月30日，已有 4种抗体获美国FDA紧急授权使用，包括: 2020年11月21日批准Ｒegeneron Pharmaceuticals 的 ＲEGEN-COV ( Casirivimab and Imdevimab) ( 重组人 IgG1 单 抗) ［31］、2021年2月9日批准的 Eli Lilly 的 Bamlanivimab and Etesevimab( IgG1 单抗) ［32］、2021年5月26日批准的GSK的 Sotrovimab ( 重组人IgG1κ) ［33］和2021年6月24日批准的 Hoffmann-La Ｒoche 的 Actemra ( Tocilizumab) ( 重组人单抗，结合IL-6［34］) 。此外，单克隆抗体在多种疾病类型中均有应用，包括靶向VEGF，治疗老年黄斑 的人源化抗体 Brolucizumab- dbll［35］; 靶向 Sclerostin，治疗骨质疏松的人源化抗体Ｒomosozumab-aqqg［36］; 靶向 C5，治疗血红蛋白尿的人源化抗体Ｒavulizumab［37］; 靶向Thrombin，用于逆转抗凝血剂的人源化抗体Idarucizumab［38］; 以及靶向IL-6，治疗Castleman病的人鼠嵌合抗体Siltuximab［39］等。自1975年Köhler和Milstein建立杂交瘤细胞后，便开启了单克隆抗体的研究工作。在这短短的四十年中，越来越多的单克隆抗体药物获批上市。此外，还有相当一部分单克隆抗体药物正处于临床试验阶段。单克隆抗体包括鼠源性单克隆抗体、人鼠嵌合抗体、人源化抗体和全人源单克隆抗体。十年来，已有 78种抗体药物在美国FDA获批上市( 不包括FDA紧急授权使用) ，涵盖肿瘤领域、免疫性疾病领域、抗病原体感染领域、代谢性疾病领域、神经系统性疾病和遗传性疾病领域等。随着对疾病研究的不断深入，越来越多的治疗性生物靶点将被揭露，单克隆抗体的应用也越来越广泛。此外，在如何提高抗体库容量、提高单个B细胞扩增效率、研究更加稳定的人源化小鼠等方面，将成为今后抗体药物开发的重点研究方向。单克隆抗体药物也必将会是药物研发领域的重要篇章，将吸引数以万计的科学家和亿万经费的投入。
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