目前实验室进行 ELISA 方法建立的人员越来越多，为了减少因人员操作导致的实验误差，避免因仪器试剂公用导致的相互之间的干扰，便于实验结果的分析和评价，现在与大家分享Elisa实验操作中需要遵守的规范。

1.包被:

准备干净的槽子，根据要包被的酶标板的数量( N )取10Nml的1*包被液到槽子中，取要包被的蛋白放置在冰盒上，吸取所需要体积的蛋白(用带滤芯的低吸附的 Tip 头)，特别要注意 Tip 头不可伸入液面太深，只需伸入液面1毫米左右，保证吸取到蛋白即可，如果发现此步操作 Tip 蘸的蛋白较多,则重新吸取。蛋白加入到包被液之前，Tip 头在蛋白保存管的内壁上稍做停靠以让 Tip 头尖尖上蘸的一点点蛋白吸附到蛋白保存管得内壁上。

加入蛋白到包被液之后，应该反复吹打几次，之后用大体积的移液器吹打混匀(枪或者枪头需要带滤芯)最后用排枪再吹打几下之后加入到酶标板中，每孔100微升，打出液体时，Tip 头尽可能的接近酶标板的底部,垂直加入。这时蛋白开始在醇标板上包被，应立即将其用质量好的干净封口袋密封,并放入到冰箱指定位置，包被过程完之后记得将包被液及时放回冰箱。

2.封闭:

包被到时的酶标板取出之后甩掉孔内液体，并且尽量拍干板子,之后用洗涤液洗涤两次，每孔110微升,洗涤浸泡时间1分钟左右，第一遍板子正放从左往右加洗涤液,第二遍上下颠倒从左往右加。两次洗涤完之后尽量拍干板子，每孔加入110微升的封闭液 SB (每次吸取和吹打 SB 的时候,移液器的手法要保持一致，SB 有一定的吸附性,容易挂枪头壁，可以吹打第一次之后适当的短暂停留之后再吹打一次，或者适当降低吹打的速度，让其在吹打的同时在重力的作用下自己向下流)，用封口袋密封,37℃温箱平放。

封闭1小时之后用多道移液器吸取出封闭液 SB 到一个干净的槽子，板子用中等力度的多拍几下以去掉蘸在孔壁的 SB ( SB 有一定的吸附性,孔底仍然会留有一些)，然后倒扣在37℃温箱干燥2小时。时间到之后取出装封口袋，并且加一包干燥剂，密封与4℃保存。

吸取出的 SB 回收到一个专用的瓶子中，并且标明使用过一次。SB 可重复使用，但仅限于封闭同一个蛋白，且封闭次数不可太多，最多不超过4次为宜。重复使用不同次数的 SB 用不同的容器装着，并都标明处理过的蛋白以及重复使用过的次数。

3.检测操作:

血清稀释液和标准品以及酶标板等其他检测用的试剂都提前取出回温，且使用前轻轻摇匀。

a .样品稀释：样品份数不管多少，都在血清稀释板上先稀释(按100微升血清稀释加入1微升血清的比例)，根据所需要的量吸取血清稀释液，并且稀释孔中加入的量比实际所需的量至少要多出20微升，如果是深孔板则至少要多出50微升，加入到检测板之前一定要记得将稀释的血清样品吹打混匀 。不同的样品记得用不同的 Tip，防止交叉污染,将样品转移至检测孔时，移液器的使用手法要一致(包括吸取和吹打的节奏以及吹打的次数)，保证每孔加入的量尽可能的相同。加入样品的检测板用质量好的封口袋密封之后，放37℃温箱孵育。血清稀释板用完之后及时用自来水洗遍，再用蒸馏水洗3遍，甩干后盖上盖子，装入封口袋中保存(不用密封)。

b .洗涤和拍板：血清孵育完之后直接甩去孔内液体后直接用洗涤液洗涤4次，洗涤体积在250-300微升之间，枪头应悬空，不要让加入到孔内的洗涤液接触到 Tip 头。每次洗涤浸泡时间1分钟左右，为保证每孔浸泡的时间尽可能一致，洗涤采取前后顺序颠倒的洗涤方式。不用每次甩去液体之后都拍干，只最后一次尽量拍干，其他中间步骤多甩几下即可，且拍板用的书要表面光滑的铜版纸。

c .酶标的选取和加入：酶标二抗有多种，并且不同的检测项目使用浓度不同，也有不含酶标二抗的纯稀释液，使用前一定要注意看瓶子上的标记，大家根据自己所需要的浓度来选取，或者直接用稀释液配制，如果发现每种浓度 Tip 头要悬空，防止交叉污染。酶标的孵育过程同血清孵育，孵育完之后的洗涤和拍板方式也一样。

d .底物的加入和显色：底物必须在临近加入前取出(即板子已经拍干之后)，并且槽子一定要干净，取的量比实际所要的量多出500微升左右，以便排枪能够顺利的吸取最后一列。每孔的加入量是50微升，底物同样有一定的吸附性，不容易吹打干净，加入的时候可以在孔的上沿短暂的停靠或者转动一圈。每列底物加入的节奏和间隔保持一致，保证加入的量以及作用的时间尽可能一致。加入底物之后，不需要密封到封口袋中，直接放温箱避光显色，这时开启酶标仪预热。底物显色一般是10分钟，具体可以根据自己的实验结果调整。装过底物的槽子立即清洗，否则底物会残留在上面会导致槽子变色，并且很难去除。

e .终止和读数：显色完之后切记不要将孔内液体甩掉，而是直接往里面加终止液终止显色反应。显色结束之前就应该先准备好终止液，这样显色完之后就可以立即终止。终止液的量与底物相同，同样每一列加入的时候节奏和间隔保持一致。终止完之后应立即读数，如果间隔时间较长的话，部分0D值高的样品的数值将明显下降。读数前如果孔内有大的气泡，则用针头将其戳破。

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